收藏本文到收藏夹环氧合酶?2在非酒精性脂肪肝病中的表达及意义【摘要】目的：探讨环氧合酶?2（cyclooxygenase?2，COX?2）在大鼠非酒精性脂肪肝（NonalcoholicFattyLiverDisease，NAFLD）中的表达及意义.方法:建立大鼠NAFLD动物模型，用免疫组化，RT?PCR，Western?blot检测COX?2在NAFLD中的表达.结果:光镜下模型组肝损伤明显，治疗组较轻.模型组血清白细胞介素?1（IL?1）及肝组织血栓素B2（TB2）比正常组明显升高（P<0.05），与模型组相比，治疗组大鼠血清IL?1及肝组织TXB2明显降低（P<0.05）；肝组织6?Keto?prostaglandinF1alpha（6?k?PGF1α）模型组较对照组低（P<0.05），治疗组较模型组升高；正常组大鼠肝细胞中COX?2mRNA几乎无表达，模型组表达阳性，与正常组比较明显升高（P<0.05）；模型组COX?2蛋白含量较正常大鼠增高（P<0.05）；经Celecoxib治疗后，同8，12wk组比COX?2的表达减弱（P<0.05）.结论：COX?2介导的酶活性增加，启动脂质过氧化反应，促进脂肪肝的形成和发展；应用特异性COX?2抑制剂，下调COX?2的表达，阻断氧应激，可减轻NAFLD的肝损害.【关键词】非酒精性脂肪肝前列腺素内过氧化物合酶白细胞介素?16?酮?前列腺素F1α血栓烷B2大鼠celecoxib是特异性的环氧合酶?2（COX?2）抑制剂，对COX?2的选择性抑制强度是对COX?1抑制作用的375倍［1］.本实验通过建立大鼠非酒精性脂肪肝（NAFLD）动物模型，研究COX?2在非酒精性脂肪肝损伤中的作用，以便进一步探讨其在NAFLD中的致病机制.1材料和方法1.1材料TRIZoL试剂盒（Invitrogen公司），MMLV第一链cDNA合成试剂盒（Invitrogen公司），TaqDNA聚合酶（华美公司），RT及荧光定量PCR试剂盒（RT?PCRKit，大连宝生物工程有限公司），内参照GAPDH和β?actin（博奥森），Celecoxib（美国Searle公司，进口注册号H20050351）；兔抗鼠COX?2多克隆抗体，浓度1∶100（Santa公司）；山羊抗兔多聚体，SABC试剂盒及COX?2免疫组化染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）.TC?l50基因PCR扩增仪（美国MJResearch）.1.2.1动物模型制备及分组成年雄性SD大鼠40只，随机分为正常对照组（n=8）和非酒精性脂肪肝模型组（n=32）［2］.非酒精脂肪肝模型组又随机分为4（n=8），8（n=8），12wk组（n=16）.12wk组又随机取8只于处死前最后14d用灌胃法给予Celecoxib10mg/kg（Celecoxib组）.所有动物均给以普通饲料、自由饮水.非酒精性脂肪肝模型组每天ig含20g/L乳清酸、40g/L胆固醇、80g/L猪油、4g/L蛋黄粉的脂肪乳剂，每次1mL（100g），早上用脂肪乳剂，晚上用生理盐水灌胃.1.2.2血清及肝组织标本制备经耳缘静脉注射30g/L戊巴必妥钠溶液麻醉大鼠，经腹主动脉取血4～6mL，分离血清保存在-70℃冰箱中待测血清丙氨酸氨基转移酶（alanineaminotransferase,ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartateaminotransferase,AST）及IL-1含量.处死大鼠后，将肝脏完整的分离出体外，取肝右叶约100mg，用生理盐水溶液制成40g/L的组织匀浆液后，离心后取上清液，-70℃冰箱内保存待测6?k?PGF1α和TXB2的含量.再取肝脏右叶组织多聚甲醛中固定，石蜡包埋切片，作HE染色和免疫组化.1.2.3免疫组化检测COX?2应用MPIAS多媒体彩色病理图纹分析系统分析COX?2相对积分光密度值，每组每张切片随机选取5个视野，像素点0.389μｍ，在9.306×104μｍ测量窗下测量并记录COX?2相对积分光密度值.1.2.4肝组织COX?2mRNA的表达应用RT?PCR技术检测COX?2mRNA在NAFLD中的表达，用TRIZOL试剂盒提取肝组织总RNA，紫外分光光度计测定RNA浓度及纯度.在逆转录酶MMLV的催化下合成cDNA，取5μLcDNA为模板在TaqDNA聚合酶催化下进行PCR扩增.COX?2的mRNA引物由上海生工生物公司设计并合成.COX?2:正链5′?ATGGCTGCAGAGTTGAAAGC?3′，负链5′?CTCTTACAGCTCAGTTGAACGC?3′，特异扩增片段为430bp;GAPDH:正链5′?AGATCCACAACGGATACATT?3′，负链5′?TCCCTCAAGATTGTCAGCAA?3′，产物为308bp.扩增条件为：94℃预变性2min，94℃变性30s，60℃退火35s，72℃扩增30s，30个循环后72℃8min.PCR产物在15g/L琼脂糖凝胶，0.5×TBE中电泳，利用GD?8000凝胶成像分析系统对扩增产物条带进行吸光度扫描，以目的基因的吸光度与GAPDH的比值表示目的基因的相对表达含量.1.2.5Western?blot检测肝组织COX?2蛋白表达冷冻的肝组织称重后用考马斯亮蓝测定蛋白含量.以每样品总量150μg蛋白加入2×SDS上样缓冲液行100g/L聚丙烯酰胺凝胶（SDS?PAGE）电泳，半干转印到硝酸纤维素薄膜上，25V电转移，时间2h；滤膜经50g/L脱脂奶粉于室温下封闭2h；一抗4℃孵育过夜；TBS洗膜；辣根过氧化物酶标记的二抗与NC膜于室温下孵育2h；TBS充分漂洗；用NBT/BCIP显色试剂盒显色；图像分析仪对显色条带进行灰度分析.统计学处理：定量数据采用x±s表示，采用SPSS（12.0）软件进行统计处理，组间均数比较用方差分析及LSD?t检验，P<0.05为差异有统计学意义.2.1大鼠非酒精性脂肪肝模型建立的评估模型组有3只大鼠死亡，有细胞感染存在.正常组大鼠肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝小叶结构清晰，肝细胞索排列整齐，无炎症细胞浸润和坏死；模型组大鼠可见肝细胞脂肪变性、气球变性、肝细胞肿胀变大、小叶内和汇管区炎症浸润及细胞点状坏死（图1），ALT，AST升高（P<0.05，表1），符合NAFLD的的诊断要求［3］.证明我们成功建立了NAFLD的大鼠动物模型.2.2血清IL?1及肝组织匀浆6?k?PGF1α和TXB2水平的变化模型组与正常组相比，IL?1，TXB2含量升高,6?k?PGF1α含量下降，差异有统计学意义（P<0.05）；经Celecoxib治疗后，IL?1，TXB2及6?k?PGF1α，同12wk组比较，差异亦有统计学意义（P<0.05，表1）.表1各组大鼠ALT，AST，IL?1，6?k?PGF1α，TXB2的变化（略）2.3COX?2的免疫组化表达模型组大鼠的肝组织内COX?2表达阳性，COX?2阳性颗粒弥漫于细胞浆，多见于肝小叶中央静脉周围的肝细胞和汇管区增生肥大的库普弗细胞（图2）；积分光密度值分析显示，COX?2的表达明显增加，且随病程的发展差异有统计学意义（P<0.05，表2）.经celecoxib治疗后，COX?2阳性颗粒明显减少，散在分布于细胞浆内（图2），同模型组比较差异亦有统计学意义（P<0.05，表2）.2.4肝组织中COX?2mRNA的表达正常组大鼠肝组织中无COX?2mRNA表达，而治疗组和模型组均有表达.COX?2mRNAPCR产物的相对表达量4,8wk组相近，均明显强于正常组（P<0.05，表2），12wk表达最强，经celecoxib治疗后，表达减弱，两组相比，有统计学意义（P<0.05，表2）.2.5COX?2蛋白相对表达量计算机BandScan软件分析COX?2蛋白相对表达量结果显示，正常组表达呈弱表达，8,2wk显著表达，与对照组相比差别显著（P<0.05，表2）.经Celecoxib治疗后COX?2表达下调，与12wk相比明显下调（P<0.05，表2）.表2肝组织COX?2相对积分光密度值、COX?2mRNA/GAPDH的灰度值及其蛋白相对表达量（略）2.66?k?PGF1α,TXB2,6?k?PGF1α/TXB2,IL?1和COX的相关性Pearson双变量分析采用Pearson双变量相关分析显示，IL?1和TXB2与肝组织COX?2水平呈正相关（分别为r:0.763,0.821;P:0.042,0.033），具有显著性意义，PGF1α与COX?2水平呈负相关（r=-0.289;P=0.026）.说明COX?2表达与NAFLD中肝脏炎症呈明显正相关.NAFLD是以肝细胞脂肪变性和脂质贮积为特征的临床病理综合征,是肝病领域面临的新挑战.6?k?PGF1α具有扩张血管、抑制血小板凝集的作用；而TXB2具有收缩血管、促进血小板凝集的作用.在生理状态下，它们在体内保持相对平衡，共同维持体内正常的内环境稳定.在有些疾病状态下其平衡将被打乱，测定它们的含量有助于了解疾病的机理及严重程度.实验显示，在肝损伤明显的模型组大鼠中，肝组织6?k?PGF1α含量下降而TXB2含量升高，经Celecoxib治疗后，肝损伤程度减轻，同时6?k?PGF1α升高和TXB2减少.实验证明，肝组织COX?2水平与TXB2与呈正相关，与6?k?PGF1α呈负相关，说明COX?2可以通过增加TXB2的合成，降低6?k?PGF1α/TXB2值而促进非酒精性脂肪肝的肝损伤.IL?1是最常见的炎症刺激因子之一.在许多细胞系中，IL?1可以使COX?2mRNA,蛋白表达量及其产物前列腺素的合成大大增加.研究发现，其能使COX?2蛋白表达量持续增加的原因是它增强了COX?2mRNA的稳定性［4］.同时IL?1和LPS等因子，能使COX?2mRNA的转录活化、介导白细胞的聚集粘附和浸润，从而导致局部炎症发生、微血管内皮损伤，表现为微循环通透性增加、组织血肿、致微循环障碍发生等［5］.这与本研究IL?1在模型组大鼠肝组织中的含量高于正常组的结果相一致，且随着NAFLD病程的进展，肝组织中IL?1活化逐步增强.此外，我们还发现治疗组大鼠肝组织IL?1含量低于模型组，其机制可能是通过抑制COX?2的活性，减少了前列腺素代谢过程中活性氧的生成.COX?2是启动炎症反应的关键酶，正常组织中不表达或弱表达，但在许多炎症因素刺激下表达升高.在酒精性肝病中，COX?2及其合成产物可以通过干扰脂肪、糖类及蛋白质的代谢，加重肝脏的氧应激和促进多种细胞因子的释放等方面产生作用，从而促进酒精性肝病的肝脏炎症、脂肪变化、肝纤维化的形成和发展［6］.实验证明，在早期的NAFLD中，COX?2表达已经升高，并伴有肝组织损伤、AST和ALT升高等变化，提示在NAFLD肝损伤过程中，早期的肝组织化学性炎症改变即可剌激COX?2表达.在治疗组，COX?2表达降低，可能与Celecoxib减轻NAFLD时的氧应激、使活性氧产物减少、降低它们对COX?2的活性和表达有关.【参考文献】［1］HawkeyCJ.COX?2inhibitors［J］.Lancet,1999,353（9149）:307-314.［2］祁培宏.消脂保肝饮抗大鼠脂肪肝作用的研究［J］.中西医结合肝病杂志,2000,5（10）:33-35.［3］中华医学会肝病分会脂肪肝和酒精性肝病学组.非酒精性脂肪性肝病诊疗指南［J］.中华肝脏病杂志,2006,14:161-163.［4］易辉,王新.还氧合酶在酒精性肝病中的作用［J］.中华肝脏病杂志,2003,11（2）:125-126.［5］RistimakiA,NarkoK,HlaTBiochemJ.Downregulationofcytokine?inducedcyclooxygenase?2transcriptisoformsbydexamethasone:evidenceforpost?transcriptionalregulation［J］.BiochemJ,1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