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有关哮喘病的基因治疗

更新时间:2012-11-28 01:12:04

    上海第二医科大学附属瑞金医院呼吸内科(200025)李伟杰 综述 邓伟吾 审校

    摘 要 支气管哮喘是一种气道的慢性炎症性疾病,具有遗传易感性,目前治疗尚不够令人满意。基因治疗有望成为未来治疗该病的一种方法,本文就这方面的情况作一介绍。

    关键词 支气管哮喘;基因治疗

    支气管哮喘(哮喘)作为一种常见病,近年来其发病率和病死率都有上升趋势。目前认为哮喘是一种气道的慢性炎症,治疗上以激素效果最佳,但是长期应用激素可带来严重的副作用,并且有些严重病例用激素不能很好控制,还有少数患者激素治疗无效(激素抵抗型哮喘),因此有必要寻求新的治疗哮喘的方法。哮喘分子遗传学的研究显示,哮喘是一种多基因参与的具有遗传易感性的疾病,因此通过基因治疗哮喘将为哮喘的防治开辟一条新道路。已有学者在这方面进行了探索。本文就哮喘基因治疗方面的情况作一综述。

    1 哮喘的发病机制及分子遗传学概述

    哮喘的发生是遗传因素与环境因素(过敏原反复接触、感染、冷空气、运动及烟草烟雾等)相互作用的结果。其确切发病机制尚不清楚,免疫反应异常在其发病过程中可能起重要作用。过敏性哮喘患者接触过敏原后,T淋巴细胞激活,增殖分化为Th2细胞,产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-IO、IL-13、GM-CSF、TNFα等细胞因子,促进B细胞增殖及Ig类型转换,产生IgE,IgE与肥大细胞及嗜碱性粒细胞膜上IgE Fc受体结合,当再次接触过敏原时,过敏原与肥大细胞及嗜碱性粒细胞表面IgE结合,相临的Fc受体发生桥联,使细胞脱颗粒,释放出组织胺、PAF、蛋白水解酶、激肽原酶、嗜酸性粒细胞趋化因子(ECF)、中性粒细胞趋化因子(NCF)及花生四烯酸代谢产物(LTB4、PGD2、LTC4、LTD4等),其中一些物质立即引起支气管收缩,发生速发型哮喘反应(IAR);同时,在ECF、NCF、LTB4等趋化因子作用下,嗜酸性粒细胞、中性粒细胞及单核一巨噬细胞向气道壁浸润,并被激活,释放出更多的炎症介质(氧自由基、PAF、ECP、MBP及花生四烯酸代谢产物等),引起微血管渗漏、粘膜水肿、腺体分泌增加、上皮损伤、通气障碍和气道高反应性,这往往发生在接触过敏原后数小时至数十小时,因此称为迟发性哮喘反应(LAR)。在哮喘的发病过程中,内皮细胞及气道上皮不仅是炎症损伤的部位,也通过释放各种活性物质在气道炎症的发生中起一定作用。

    人们很早就从哮喘的家系分析中发现,哮喘是一种具有遗传易感性的疾病。近年来随着分子生物学的飞速发展,哮喘的分子遗传学研究取得了很大的进步,国内外学者在这方面已进行了较多的研究,其中主要集中在参与免疫反应的基因方面,包括人类白细胞抗原基因(位于6p),T细胞抗原受体a/δ链基因(14qll.2),细胞因子基因簇(5q31一32)及IgE高亲合力受体β亚单位基因(11q13),这些研究的结果显示,这些基因(多态性、突变或异常表达)与哮喘有一定相关性存在。另外,有研究显示,某些基因的多态性(β肾上腺素受体及IL-4基因启动子序列)与哮喘严重程度相关,但这些结果尚有待于进一步研究证实。

    2 哮喘基因治疗策略

    基因治疗是指运用DNA重组技术设法修复或调节细胞中有缺陷基因,使细胞恢复正常功能,以达治疗疾病的目的。主要的方法有原位修复有缺陷的基因、用正常基因替代有缺陷的基因、添加基因、基因封闭等。哮喘的分子遗传学显示,哮喘是一种有多基因参与的遗传性疾病,因此不可能进行象肺囊性纤维化一样的单基因治疗。有研究表明,哮喘与FCεRIβ基因、β2肾上腺素受体基因及IL-4基因启动子等基因突变或多态性有关,若这些结果得到证实,这些基因位点将成为基因治疗的靶位点,通过基因修复或替换而达治疗哮喘的目的。另外,抑制促炎细胞因子基因或炎症介质代谢过程关键酶基因的表达,或转入IFNγ及1L--12等抑制TH2免疫反应细胞因子的基因,使它们在肺部表达,也可达到控制哮喘的目的。选定了目的基因,运用分子生物学技术分离、纯化基因,基因重组,然后通过载体转入体内,这就是基因治疗的全过程。真核细胞中的基因转移方法主要有理化法和病毒转移法。呼吸道有极大的被覆上皮的表面积,因此可以上皮细胞作为基因治疗的靶细胞,通过雾化吸入方式将目的基因转入,这样不仅可以保证使目的基因在肺脏局部发挥作用,还可以减小由体循环注入引起的副作用。另外,也可体外转染淋巴细胞或单核一巨噬细胞,然后再回输体内,使其在肺部释放出目的基因编码蛋白,调节机体免疫反应。

    3 哮喘基因治疗的研究

    3.l 转入抑制变态反应的细胞因子基因Thl/Th2平衡在免疫调节中起着重要作用,已证实,哮喘患者存在着T细胞向Th2细胞的优势转化,这种优势的Th2免疫反应在哮喘发病机制中起重要作用。IL-12可诱导T细胞向Thl细胞方向转化,Thl细胞产生的细胞因子IFNγ可抑制Th2细胞因子的产生,因此转入这些细胞因子的基因,使它们在体内表达,从而可达到治疗哮喘的目的。Hogan等用病毒载体向致敏小鼠气道粘膜转染IL-12基因后发现,IPNγ表达增加,Th2细胞因子产生明显受到抑制,气道反应性明显减低,同时由于细胞介导免疫的建立,气道病毒感染很快得到控制。Li等在过敏性哮喘的小鼠模型上也发现,向气道粘膜转染IFNγ基因,可引起气道上皮IFNγ显著表达,从而抑制抗原和Th2细胞诱导的肺部嗜酸性粒细胞浸润和气道高反应性。Ohkawara等用重组腺病毒载体向卵蛋白致敏小鼠转染IL-10基因,发现支气管肺泡灌洗液中细胞总数、嗜酸性粒细胞数及IL-5水平显著下降,气道炎症明显减轻。

    3.2 DNA接种 DNA接种是近年来发展起来的一种安全有效的免疫治疗方法。DNA接种可以诱发Thl引导的免疫应答(细胞免疫),并对Th2引导的免疫应答起抑制作用。主要有CpG DNA接种、过敏原DNA接种等形式。细菌DNA含有大量非甲基化的CpG序列(70%~90%非甲基化),而脊推动物DNA含有很少的CpG序列,并且绝大部分已甲基化(5%非甲基化),模拟细菌DNA,体内注入CpGDNA序列,可使B细胞,自然杀伤细胞IFNγ分泌增加,诱导Thl细胞分化。 CpGDNA需要有一定的寡核苷酸顺序,并且要有8~3O或更多的寡核苷酸才能引起免疫刺激作用。Broide等研究发现,DNA免疫可以减轻嗜酸细胞浸润、气道高反应性和IL-5的产生。SUr等的研究进一步证实了上述结果,认为CpGDNA接种可防治变态反应性肺部炎症。过敏原DNA接种或过敏原DNA和CpGDNA一起接种可引发特异的Thl免疫应答,从而对该过敏原引起的过敏反应起保护作用。Raz争的研究发现,用编码大肠杆菌β-半乳糖苷酶(β一gal)的质粒DNA免疫小鼠可引起特异的Thl免疫应答,而β-gal免疫动物可引起对同一抗原的Th2免疫应答,质粒β-galDNA皮内注入β-gal致敏小鼠可使特异性的IgE水平下降66%~75%。Spiegelberg等的研究也发现了基本相似的结果。

    有研究表明,用HDM抗原的质粒DNA对大鼠进行肌肉注射,可明显阻止雾化吸入HDM所致的IgE的合成、组织胺释放和气道高反应性。 

    3.3 反义寡核苷酸 反义寡核苷酸是一种单链核苷酸,一般为15~24个碱基,可特异地与目的蛋白的mRNA结合,使翻译受阻,从而起到基因封闭作用,也是较常用的一种基因治疗或称为基因后治疗方法,具有高效、特异、设计方便、副作用小等优点,目前亦有用于哮喘实验性治疗的报道。考虑到腺苷在哮喘发病中可能起一定作用,Nyce等用针对腺苷A1受mRNA的反义寡核苷酸雾化吸入治疗哮喘的兔模型,结果发现,雾化吸入后,腺苷及屋尘螨(HDM)引起的气道收缩明显减轻。

    3.4 其它过敏原与B细胞表面IgE结合,可引起细胞的增殖、活化和IgE产生,因此清除表达膜IgE的B细胞可达控制哮喘发作的目的。Lustgarten等转染整合有非过敏性抗IgE抗体可变区编码序列的TCR基因T细胞,使T细胞表达IgE抗体,结合B细胞表面IgE,从而长期持续清除lgE产生细胞,避免过敏反应的发生。免疫细胞激活后,诱发转录因子,如AP-l复合体(jun/fos或jun/jun)和核因子κB(NF-κB)基因的表达,进一步诱发各种细胞因子的产生,同时这些转录因子还可抑制激素受体基因的表达,在激素抵抗到哮喘的发病过程中起一定作用,因此抑制转录因子基因的表达,在哮喘的治疗中亦可能起一定作用。Wrighton等用腺病毒载体转染I-kBα(转录因子NF-κB抑制剂)基因,内皮细胞转染这种基因后,脂多糖刺激所致内皮细胞激活明显受抑制,VCAM—l、IL-l、IL-6、IL-8等的合成明显a减少,从而可能在哮喘治疗中起一定作用。

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