PCR快速测定法在检测海河水体非01群霍乱弧菌中的应用（丁建清王书梅田永琴李力杨艳丽）

http://www.hwcc.com.cn时间：2007-04-1610:54:09来源：《环境与健康杂志》放大缩小打印
表1

摘要:目的合成一对霍乱弧菌外膜蛋白引物,采用PCR技术对海河水系非01群霍乱弧菌感染状况进行了检测。方法在海河水系5处水点采集水样102份,以PCR技术和常规分离培养进行了比较,以非01群霍乱弧菌Vbo35型、志贺痢疾、伤寒、大肠杆菌作为PCR扩增时的阴、阳性对照。结果102份水样PCR检测总阳性率为52%,扩增片段588bp,与常规分离培养比较,符合率为100%。结论霍乱弧菌外膜蛋白引物快速检测海河水系非01群霍乱弧菌敏感性高,特异性强,可提高检测速度4～5倍,为非01群霍乱的防治提供了一种有用的检测手段。

关键词:基因;弧菌,霍乱;外膜蛋白引物;非01群霍乱弧菌;基因扩增;海河水系

中图分类号:R123.2文献标识码:A

RapidDetectionofNon-01VibrioCholeraeinHaiheRiverbyVibrioCholeraeOuterMembraneProteinGene（ompw）PCRTechnologyDINGJian-qing,WANGShu-mei,TIANYong-qin,etal.TianjinMunicipalCenterforDiseaseControlandPrevention,Tianjin300011,China

Abstract:ObjectiveTodetectpollutionstatusofnon-01VibriocholeraeinHaiheriverbyVibriocholeraeoutermembraneproteingene（ompw）PCRtechnology.MethodsApairofVibriocholeraompwprimerswassynthetizedtodetectnon-01Vibriocholeraein102watersamplescollectedfrom5samplingsitesinHaiheriverbyompwPCRapproachandtheresultswerecomparedwiththatoftheroutinebacterialseparationculturemethod.WhenamplifiedbyPCR,isolatednon-01VibriocholeraestrainVbo35wasusedaspositivereference,Shigella,E.coliandSalmonellastrainswereusedasnegativereferenceinthestudy.ResultsThetotalpositiverateofVibriocholeraein102watersampleswas52%andtheamplifiedproductswere588bp.ThedetectionresultsofthePCRapproachwere100%inaccordwiththatoftheroutinebacterialseparationculturemethod.ConclusionTheresultsindicatedthatompwPCRtechnologywasahighlysensitiveandspecificmethodtodeterminationofnon-01VibriocholeraeinHaiheriverwatersystem,itshortenedthedeterminationtime4～5times,andcouldprovidedausefuldeterminationmethodfornon-01Vibriocholerae.

Keywords:Gene;Vibrio,cholerae;Outermembraneproteinprimers;Non-01Vibriocholerae;Geneamplification;Haiheriverwatersystem

非01群霍乱弧菌感染的病原学诊断主要是以分离培养和临床特点进行确诊,但由于这些方法费时费力,且诊断血清昂贵,细菌学鉴定中常常忽略,从而经常造成误诊、漏诊,给临床治疗带来一定的困难,因此,探索快速、简便、特异的病原学诊断技术是细菌学工作者近年关注的热点。鉴于此,我们根据Bisweswar[1]报道的霍乱弧菌编码外膜蛋白ompw基因扩增引物序列采用PCR法对天津市海河水中非01群霍乱弧菌进行鉴定,以检验该方法实际应用的可行性,为将来本市开展非01群霍乱弧菌的调查和临床应用所借鉴。

1材料与方法

1.1.1标准对照菌株非01Vbo35（非01霍乱弧菌血清35型）为本室分离保存,阴性参考菌株大肠杆菌、志贺痢疾、伤寒杆菌均购自中国药品生物制品检定所。

1.1.2水样采集被检样品于2001年6月初采自天津市海河水系的大光明桥、广场桥、赤峰桥、三叉口及狮子林桥5处水点,采样时每一水点分别以5m为一采样间距各采水样2份。

1.1.3引物参照文献[1]上游引物为:5’-CACCAAGAAGGTGACTTTATTGTG-3’;下游引物为:5’-GAACTTATAACCACCCGCG-3’,预期扩增ompw基因588bp片段。

1.1.4试剂TaqDNA聚合酶和dNTPs购自华美生物工程公司,琼脂糖由上海东海制药厂生产,其他缓冲体系试剂均为本实验室自行设计配制。分离培养、细菌鉴定用碱性蛋白胨水、四号琼脂,各种生化鉴定用培养基等均由本实验室自行配制,霍乱诊断血清购自中国药品生物制品检定所。

1.1.5仪器PTC-150DNA扩增仪、紫外核酸检测仪、电泳仪等。

1.2.1被检水样增菌每份水样9ml加入1ml10×浓缩碱性蛋白胨水,置37℃2.5h增菌,取出一部分作PCR扩增,其余增菌液继续增菌至8h作细菌鉴定。

1.2.2模板制备取增菌液0.5ml加入灭菌的离心管中,8000r/min离心5min,倾上清,加入100μl灭菌无离子水混悬,置100℃沸水中煮10min,取出12000r/min离心10min,吸上清即为DNA粗制模板,阳性和阴性参考菌株除不作增菌外,其余步骤与被检样品相同。

1.2.3PCR扩增在灭菌的0.5ml离心管中依次加入10×PCR缓冲液2μl,混合dNTPs0.4μl,氯化镁0.6μl,上、下游引物各0.4μl,灭菌无离子水15.3μl,粗制DNA模板0.8μlTaqDNA聚合酶0.1μl,总反应体积20μl,最后加入15μl左右液体石蜡封管,置DNA扩增仪先行94℃5min预变性,后续循环94℃45s,58℃45s,72℃1min;行30个循环,最后72℃延伸7min。

1.2.4扩增产物检测取扩增产物10μl加入2μl6×的载样缓冲液,在1.5%琼脂糖凝胶中（含EB0.5μg/ml）进行电泳。每块胶板设DNAMarker作为标准分子量对照,电泳完毕紫外灯下观察结果。

2.1PCR检测结果

共采集5处水样102份,PCR检出阳性53份,阳性率为52%。大光明桥、赤峰桥等5处水点扩增阳性率分别为31.8%、65%、45%、25%、95%。文中采用阳性标准参考菌株、混合阴性参考菌株及自来水为对照进行检测结果表明,阳性对照扩增出了588bp的阳性扩增带,阴性混合对照及自来水扩增结果均为阴性,结果见表1。

2.253株非01群霍乱弧菌常规鉴定结果

分离出的53株非01群霍乱弧菌在碱性蛋白胨水中增菌8h后大部分能形成菌膜,在4号琼脂平板上菌落光滑、湿润、呈半透明状,氧化酶及拉丝试验均为阳性;发酵葡萄糖产酸不产气;蔗糖甘露糖均为阳性;赖氨酸、鸟氨酸阳性;精氨酸阴性;在TCBS琼脂上菌落为黄色;靛基质、VP实验均为阳性;阿拉伯糖三株出现弱阳性;在无盐胨水中生长,7%以上盐胨水不生长。采用01群霍乱弧菌多价、小川、稻叶、粗糙血清及0139血清作凝集均为阴性,结果见表2。

霍乱弧菌的鉴定技术近年发展较快,尤其以PCR技术为代表的分子生物学技术更为流行病学提供了方便。如在霍乱弧菌PCR检测方面已设计出了CT、zot、ace等不同毒素基因用于快速检测霍乱弧菌[2]。但上述技术主要对能产生各种毒素的菌株进行检测。利用外膜蛋白ompw的PCR检测非01群霍乱弧菌国内未见应用报道,根据文献[1]的方法,合成一对用于非01群霍乱弧菌的引物进行PCR检测证明,该方法特异性高,敏感度强,样品中只需10个菌细胞就可检出。通过对天津市海河水系采样检测发现,水样增菌2h即可进行扩增。该技术另一优点在于制备模板方法简便,从采样到完成整个实验仅需5h,与细菌分离培养相比可提前2d出具报告。

文献报道,PCR检测技术,扩增温度循环参数直接或间接影响扩增结果,尤其是退火温度在扩增过程中对DNA复性和变性影响较大,而且不同品牌的DNA扩增仪,样品对所需温度也不尽相同。我们研究发现,外膜蛋白引物检测非01群霍乱弧菌复性温度从52～68℃之间均不影响扩增效果,笔者根据多次重复检测后,采用58℃作为本文研究复性温度参数。

霍乱弧菌外膜蛋白是存在于霍乱弧菌菌体表面的重要成分,作为粘附因子与宿主肠粘膜细胞相互作用。霍乱弧菌外膜蛋白结构复杂,由多种蛋白质成分组成,相对分子质量由13000～94000不等。文献报道,霍乱弧菌相对分子质量22000的外膜蛋白是存在于霍乱弧菌菌体表面特有的蛋白组分,自该蛋白成分中取出特异的片段合成引物,以检测产毒和非产毒霍乱弧菌其效果要比其他编码基因引物更好。我们在文献介绍的基础上合成一对引物用以检测天津市海河水体非01群霍乱弧菌所获结果与文献报道一致。

本次检测结果看出,采用PCR扩增和细菌常规鉴定2种方法其符合率为100%。海河水系非01霍乱弧菌阳性检出率达52%,三叉口地区阳性检出率高达95%。5处水点检出率差异较大,可能三叉口地区河床周围垃圾、污水堆积流入河道污染水体或三叉口属半死水区而使非01群霍乱弧菌在此得以大量蓄积有关。

[1]BisweswarN,RanjankKN,SarmishthaM,etal.Rapidmethodforspecies-specificidentificationofVibriocholeraeusingprimerstargetedtothegeneofoutermembraneproteinompw〔J〕.JClinMicro,2000,38:4145-4151.

[2]段广才,高守一,刘延清,等.霍乱弧菌PCR快速检测及应用研究〔J〕.中华微生物学和免疫学杂志,1994,14（6）:376.

作者简介:丁建清（1955-）,男,副主任技师,主要从事微生物学、流行病学研究。

来源：《环境与健康杂志》2002年11月第19卷第6期

表2
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