关键词：血管性血友病；无义点突变；变性梯度凝胶电泳本课题受国家自然科学基金和中法科协先进研究项目资助摘要目的：研究3型血管性血友病（vWD）的分子病理机制。方法：应用聚合酶链反应（PcR）结合变性梯度凝胶电泳（DGGE）筛选了3型vWD患者vonWillebrand因子（vWF）基因编码区的基因突变，对PCR-DGGE行为发生改变的片段直接进行DNA序列分析。结果：检测到1例基因突变，在vWF基因外显子3第212号核苷酸，发生了C→A的替换，使Ser71突变为终止密码子。该突变创造了XbaⅠ酶切位点，消除了原有的TaqⅠ位点。结论：PCR-DGGE和酶切分析均证实，患者为该突变的纯合子，其父母则均为该突变的携带者。Detectionofgenemutationandgeneticanalysisofapatientwithtype3vonWillebranddiseaseLiZhenyu*,WangYong,WanHaiying,etal.*FirstAffiliatedHospitalofSuzhouMedicalCollege;ThrombosisandHemostasisResearchUnit,JiangsuInstituteofHematology,Suzhou215006AbstractObjective:Toidentifygenemutationsinpatientswithtype3vonWillebranddisease.Methods:TheencodingregionofvonWillebrandfactor（vWF）genewerescreenedbypolymerasechainreactionanddenaturinggradientgelelectrophoresis（PCR-DGGE）.Resultsandconclusion:ThefragmentofvWFgeneexon3fromapatientwithtype3vonWillebranddiseasedisplayedanabnormalmeltingbehavior.DirectsequencingdemonstratedahomozygousC→Atransitionatnucleotide212invWFgeneresultinginthesubstitutionofastopcodonforSer71.TheparentsofthepatientwereheterozygousforthismutationasidentifiedbyPCR-DgGEandrestrictionendonucleasedigestionanalysis.KeywordvonWillebranddiseaseNonsensemutationDenaturinggradientgelelectrophoresisvonWillebrand因子（vWF）是一种高分子量糖蛋白，在体内以多聚体形式存在，vWF主要由内皮细胞和巨核细胞合成。vWF基因位于12号染色体，全长178kb，含52个外显子、51个内含子，其mRNA长约8.7kb，编码2813个氨基酸的前体蛋白［1］。在22号染色体上存在一vWF假基因，它和vWF基因外显子23～34的序列约有97%的同一性［2］，给血管性血友病（vWD）的分子病理机制研究带来困难。我们应用聚合酶链反应结合变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术，首次在我国检测到1例3型vWD患者的基因缺陷，现报道如下。材料和方法1病例资料患者，男，17岁。自1岁起常有鼻衄，皮肤瘀点、瘀斑和牙龈出血，5岁时曾有关节血肿，平时常需输血、止血治疗。其父母为表姐弟，家族中无类似患者。出血时间采用一次性出血时间测定器测定；FⅧ∶C采用一期法测定；FⅧ∶Ag采用ELISA法测定（试剂由stago公司提供）；vWF∶Ag采用ELISA法测定（试剂由本室自制）。2基因扩增按本室常规抽提外周血白细胞基因组DNA，方法见文献［3］。引物序列为：有义链3A：5′-GGTCCCAGTTGTGCCCTGAG-3′;反义链3B：5′-（GC）50AGCCCTCCCTCTGAAGTCCT-3′;反应总体积为50μl，其中含200μmol/LdNTP，各10pmol的上述引物和0.5μgDNa模板，95℃变性5分钟后加1.25UTaqDNA聚合酶（Sangon公司）和50μl液体石蜡。PCr条件为：94℃变性30秒，60℃30秒退火，74℃30秒，且每个循环加1秒延伸，最后1个循环延伸7分钟，共35个循环。1.5%琼脂糖电泳检查PCR扩增产物。3DGGEPCR扩增产物经等量氯仿-异戊醇（24∶1）抽提一次，置95℃变性10分钟，42℃1小时复性后，取10μl行DGGE分析。变性梯度为20%～80%（100%的变性梯度为7mol/L尿素和40%甲酰胺）。置60℃恒温下，120V电泳5小时，1μg/ml溴乙锭染色15分钟，紫外灯下观察电泳结果。4PCR扩增产物的克隆与序列分析PCR扩增产物经补平、磷酸化和纯化后转入克隆载体puC18，采用Sanger脱氧链终止法测定DNA序列［3］。5TaqⅠ酶切分析将PCR扩增产物经等量氯仿-异戊醇（24∶1）抽提一次，取10μl加TaqⅠ20U（华美公司），65℃酶切过夜，反应体积20μl。8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检查酶切结果。6XbaⅠ酶切分析取PCR产物10μl加XbaⅠ20U（Promega公司），37℃酶切过夜，反应体积20μl。8%的PAGE检查酶切结果。结果1患者及其父母的实验室资料见附表。附表3型vWD患者及其父母的主要检查结果　检测对象出血时间　　（min）vWF∶AgvWF∶Co　　（U/L）FⅧ∶Ag　　（%）患者＞155＜502.8患者父亲正常6867.0　患者母亲正常8273.0　2DGGE分析PCR扩增产物长300bp，在行DGGE分析时，标本S239DNA片段的电泳行为发生了改变，迁移速度变慢，结果见图1。家系分析发现其父母均为杂合子，出现了典型的四条带图形，而患者则为纯合子。3DNA序列分析对标本S239进行Sanger双脱氧DNA序列分析，发现该片段在212位核苷酸发生了C→T的替换，使第71位密码子Ser突变为终止密码子。4TaqⅠ和XbaⅠ酶切分析TaqⅠ和XbaⅠ酶切均证实该突变创造了XbaⅠ酶切位点，而失去了原有的TaqⅠ酶切位点，结果分别见图2，3。TaqⅠ和XbaⅠ酶切也证实了S239为纯合子，而其父母则均为杂合子。A：患者父亲；B：患者母亲；C：患者；D、E和F：正常对照1：正常条带；2：突变体；3和4：两种异二聚体图1vWF基因外显子3的DGGE分析1：DNA标记，PBR322/HaeⅢ；2和3：正常对照；1：DNA标记，PBR322/HaeⅢ；2和3：正常对照；4：患者；5：患者父亲；6：患者母亲4：患者；5：患者父亲；6：患者母亲图2PCR产物经TaqⅠ酶切后的PAGE图图3PCR产物经XbaⅠ酶切后的PAGE图讨论vWD是一种常见的遗传性出血性疾病，是由于自体vWF先天性质或量的缺陷所致。vWD分3型：1型为vWF量的减少，该型占vWD患者总数的75%～80%；2型为vWF质的异常，vWf量可以正常或减少，占vWD总数的15%～20%；3型为vWF量的极度减少或缺如，该型最少，占1%～5%［4］。1型和2型患者主要以常染色体显性方式遗传，男女均可发病，而3型则以常染色体隐性方式遗传。该患者的父母为近亲结婚，他们均无明显出血倾向，vWF∶Ag、FⅧ∶Ag均基本正常，符合常染色体隐性遗传方式。vWF在体内主要有两个作用：一方面，可以和受损血管内皮下组织结合，参与初期止血过程；另一方面，在血浆中和FⅧ非共价结合，保护FⅧ，使之免于过早降解［1］。3型vWd由于体内vWF的极度减少，患者存在严重的初期止血障碍，表现为出血时间延长，皮肤粘膜出血。另外，FⅧ由于失去了vWF的保护，降解加速，因此也存在凝血功能的异常。该患者出血时间明显延长，以鼻衄，牙龈出血和皮肤瘀点、瘀斑为主要表现，而FⅧ∶Ag仅为2.8%（正常50%～150%），病史中曾有关节血肿史，因此该患者存在初期止血和凝血功能两方面异常。在已经发现的3型vWD基因缺陷中，主要有3种机制：基因缺失、基因插入和无义点突变。另外发现部分患者存在复合型错义点突变而无其它异常。本患者是由于其vWF基因第3号外显子存在一无义点突变，导致了vWF合成的提前终止。患者为该突变的纯合子，是由于近亲结婚所致。PCR-DGGE分析是检测基因突变的有效方法，在遗传性出血性疾病中应用广泛，包括血友病A、血友病B、vWD等。它具有快速、灵敏、无放射性物质污染等优点，适合于大样本筛选。在DGGE检测中，DNA分子单个碱基的替换即可导致DNA片段在变性梯度递增的PAGE中局部DNA分子的解链温度发生改变，影响了DNA片段的迁移速度［6］。为保证DNA片段在电泳中双链不完全打开，常需在一侧加“GC”夹，以提高该侧的解链温度。在vWD，如果为杂合子患者，其DNA片段存在两种纯二聚体和两种异二聚体，异二聚体发生解链的温度更低，更有利于和正常的片段分开，在本研究中，患者父母为该突变的杂合子，因此形成了典型的“四条带”图形，而患者的DNA片段与正常条带变化轻微。我们的结果还表明，PCR-DGGE技术可以很好地用于vWD家系携带者的检测。另外，如果检测到的基因突变产生了新的酶切位点或消失了原有的酶切位点，那么就可以根据酶切位点的改变快速地进行vWD的家系分析。所以vWD基因突变的发现，对于阐明vWD的分子病理机制、开展vWD家系的遗传咨询均具有重要意义。参考文献1SadlerJE.vonWillebrandfactor.JBiolChem,1991,266:22777-22780.2MancusoDJ,TuleyEA,WestfieldLA,etal.HumanvonWillebrandfactorgeneandpseudogene:structuralanalysisanddifferentiationbypolymerasechainreaction.Biochem,1991,30:253-269.3李震宇，傅建新，万海英，等.变性梯度凝胶电泳检测到一种新的凝血因子Ⅷ基因突变.中华血液学杂志，1996，17：466-468.4SadlerJE.ArevisedclassificationofvonWillebranddiseaseforthesubcommitteeonvonWillebrandfactorofthescientificandstandardizationcommitteeoftheinternationalsocietyonthrombosisandhaemostasis.ThrombHaemost,1994,71:520-531.5MyersRM,ManiatisT,LermanLS.Detectionandlocalizationofsinglebasechangesbydenaturinggradientgelelectrophoresis.MethEnzymol,1987,155:501-527.6GinsburgD,SadlerJE.vonWillebranddisease:adatabaseofpointmutations,insertionsanddeletions.ThrombHaemost,1993,69:177-184.（收稿：1997-05-27修回：1997-10-27）（校对：徐丽娟）上一个文章：紫外线波段B对脐血免疫活性和造血活性抑制的体外研究下一个文章：PTA1单克隆抗体诱导人血小板活化聚集和胞浆Ca2+水平的升高