摘要：本文旨在探讨大鼠蛛网膜下腔出血（SAH）诱发脑血管痉挛时脑底动脉降钙素基因相关肽（CGRP）能神经纤维的变化。大鼠随机分为正常组、蛛网膜下腔出血组。SAH组大鼠取股动脉自体血注入蛛网膜下腔,正常组动物不做任何处理。3d后灌注固定后,应用免疫组织化学ABC法,对两组大鼠脑底动脉CGRP能神经纤维变化进行观察。结果显示:正常组大鼠脑底动脉可见棕褐色,细线状CGRP能免疫反应阳性纤维;而SAH后3d组大鼠脑底动脉与正常组大鼠脑底动脉相比CGRP能神经纤维密度明显减少,具有统计学意义。以上结果提示脑底动脉CGRP能神经纤维在蛛网膜下腔出血诱发脑血管痉挛的病理生理过程中可能发挥重要的作用。　　　　关键词：蛛网膜下腔出血脑血管痉挛降钙素基因相关肽神经纤维　　　　蛛网膜下腔出血（subarachnoidhemorrhage,SAH）后30%～70%患者发生脑血管痉挛（cerebralvasospasm,CVS）,其中40%患者会因为迟发性神经功能缺损而致残和致死。目前有关SAH诱发CVS的研究虽然很多,但其发生机制仍然不清楚。我们组以前的研究表明SAH诱发CVS后脑底动脉上NPY,ET21能神经纤维的量发生变化,提示脑血管的神经调节机制在SAH诱发CVS中有重要作用[1,2]。本文通过制作大鼠蛛网膜下腔出血模型,应用ABC免疫组织化学技术观察出血诱发脑血管痉挛后脑底动脉降钙素基因相关肽（calcitoningenerelatedpeptide,CGRP）能神经纤维的变化,以探讨CGRP能神经纤维在SAH诱发CVS的神经源性调节中的作用,为深入研究脑血管痉挛发病机制提供形态学资料。　　　　材料和方法　　　　1.实验动物分组和固定　　　　Wistar大鼠28只,雌雄不限,体重300～350g。随机分为正常组和SAH组,每组14只。蛛网膜下腔出血模型制作[3]如下:SAH组大鼠用1%戊巴比妥钠（35mg/kg）腹腔麻醉,在前囟前5mm和右外侧3mm处钻一直径为2mm骨孔。在额极挑破硬脑膜,将PE210管向下向后沿皮层表面方向插入1cm,管腔中可抽到清亮脑脊液,证实位于蛛网膜下腔。然后用502胶水封住骨孔,从股动脉抽取0.2ml非肝素化自体血液立即注入蛛网膜下腔。3d后,大鼠经1%戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔麻醉,经升主动脉插管灌注200ml生理盐水,而后继续灌注含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）400ml,约1h后取脑。在解剖显微镜下剥离大脑前动脉、大脑中动脉、大脑后动脉和基底动脉,浸入20%蔗糖磷酸缓冲液,在4℃冰箱过夜。根据Hsu等[4]人的免疫组织化学ABC法,显示血管上的神经纤维。　　　　2.染色过程　　　　血管经下列程序染色:（1）正常羊血清用含0.3%TritonX2100的TBS（Tris2HClbuffer）稀释（1∶20）后4℃孵育标本1h;（2）小鼠抗CGRP血清（1∶2000,Sigma公司）4℃孵育标本48～72h;以后每步骤完成后均用磷酸盐缓冲液洗3次,每次5min;（3）生物素结合的羊抗鼠IgG（1∶200,Vector公司）室温下孵育标本12h;（4）亲和素2生物素2过氧化物酶复合体（1∶100）室温下孵育标本2～4h;（5）以0.05%二氨基联苯胺（DAB）/0.01%H2O2显色5～10min,常规脱水透明封片,显微镜下观察。　　　　3.统计学处理　　　　神经纤维密度计数,参照Kaboyashi[5]的神经纤维计数法,在各动脉距大脑动脉环起始处1.0mm以内进行。在20倍物镜下,使网格X轴与血管长轴平行,Y轴与血管横轴垂直。随机选取三段长0.1mm的血管,计数其血管壁神经纤维与网格线的交叉点,取平均值表示该动脉的神经纤维密度。把数据输入计算机,以统计分析软件SPSS10.0行SNK2q检验分析处理。P<0.05为有统计学意义。　　　　结果　　　　正常鼠和模型鼠动物脑底动脉均可见棕褐色、细线状的CGRP能免疫反应阳性纤维,但SAH3d组大鼠脑底动脉上的CGRP能阳性神经纤维与正常组相比明显减少,经统计学分析P<0.05,表明两者间有显著的差别（表124,Figs.124）。　　　　讨论　　　　蛛网膜下腔出血与脑血管痉挛,脑血流减少和自主调节损伤有关。脑血管痉挛是以颅内压升高、脑血流降低等为特征的动脉收缩。可通过血管造影术证实,在临床上可无症状、也可产生神经源性缺陷或致死。它是SAH的主要并发症,但它的病理机理仍然是一个争论的问题。其中蛛网膜下腔出血后脑血管中神经纤维分布的变化对SAH诱发脑血管痉挛的作用已经引起人们的重视。我们以前的研究发现蛛网下腔出血后脑底动脉ET21能神经纤维密度明显增多,提示内皮素在CVS中发挥着重要的作用[2]。然而CGRP是体内最为强烈的舒血管活性物质,作为ET缩血管的强大拮抗剂,在预防和治疗SAH后CVS损伤方面极具潜力。　　　　CGRP是由37个氨基酸残基组成的生物活性肽,主要来源于颅内大动脉周围的神经纤维,在三叉神经末梢内浓度较高。CGRP神经纤维呈网状包绕动脉壁,是神经血管间信息传递的主要神经递质,它通过激活血管平滑肌细胞膜上特异受体发挥生物学作用。我们通过制作大鼠蛛网膜下腔出血模型,应用免疫组织化学ABC法检测脑底动脉上CGRP能神经纤维的变化,结果显示正常鼠脑底动脉可见棕褐色、细线状的CGRP能免疫反应阳性纤维。SAH后3d组大鼠脑底动脉与正常组相比CGRP阳性神经纤维密度明显减少,且具有统计学意义。李合华等[6]通过放免法发现伴有CVS的SAH患者血液中CGRP的浓度比不伴CVS的SAH患者明显降低。吴军等[7]采用RT2PCR技术检测大鼠SAH后CVS处脑组织CGRP的表达,发现注血后3dCGRP的表达明显下调。Inoue等[8]研究发现,实验性SAH后第4～7d出现CVS,鞘内注入CGRP可缓解CVS,提示CGRP减少是SAH后CVS发病的重要原因。CGRP作用于其特异性受体,激活腺苷酸环化酶,引起细胞内环磷酸腺苷水平升高。后者发挥第二信使作用,激活蛋白激酶,使ATP敏感钾通道关闭,引起膜超极化,电压依赖性Ca2+通道关闭,细胞内Ca2+浓度降低,从而使血管舒张[9]。CGRP还可拮抗内皮素的作用[10]。SAH后颅内压增高,灌注压降低致脑缺血,神经元变性坏死;另外,CGRP与受体结合障碍,细胞内环磷酸腺苷水平下降,使CGRP合成和释放减少,消耗增多,从而ET释放增多,导致脑血管收缩[11]。因此观察脑动脉上CGRP能神经纤维的变化有助于探讨蛛网膜下腔出血诱发脑血管痉挛的机制。　　　　参考文献　　　　[1]熊建忠,祝高春,邵立健.蛛网膜下腔出血大鼠脑底动脉神经肽Y能神经纤维的表达变化与脑血管痉挛的关系.江西医学院学报,2003;43:43-45　　　　[2]祝高春,李桂林,邵立健.蛛网膜下腔出血后大鼠脑底动脉内皮素21能神经纤维的表达变化.神经解剖学杂志,2006;22:547-550　　　　[3]季鹰,吴建中,赵雅.一种新的蛛网膜下腔出血（SAH）动物模型的建立.中华神经外科杂志,1991;7:11-13　　　　[6]李合华,王平梅,毛兴爱.蛛网膜下腔出血患者血清与脑脊液中NO和CGRP水平变化及意义.山东医药,2006;46:1-3　　　　[7]吴军,周春奎,饶明俐等.实验性SAH后CVS大鼠脑组织CGRPmRNA表达研究.中风与神经疾病杂志,1996;16:260-262　　　　[9]邢红霞,王玉梅,李合华等.亚低温治疗对蛛网膜下腔出血继发性血管痉挛及脑脊液和血浆内皮素、降钙素基因相关肽的影响.神经病学杂志,2007;20:465-467　　　　[10]陈军花,周政,杨梅华等.ET21和CGRP在颅脑创伤后脑血管痉挛中的作用.重庆医学,2007;36:2269-2271　　　　[11]张泽兰,谭华,陈秀等.蛛网膜下腔出血与内皮素和降钙基因相关肽的关系研究.中国现代医学杂志,2000;10:10-11