摘要:目的建立实验性蛛网膜下腔出血后内皮细胞损伤模型，并观察血性脑脊液（bloodycerebralspi-nalfluid，BCSF）对培养的微血管内皮细胞的损害作用。方法将体外培养的兔脑微血管内皮细胞分为对照组和BCSF刺激组，通过MTT比色法选择恰当孵育时间的BCSF作为刺激因素，观察病理形态学改变、细胞计数、流式细胞术细胞周期，分析评估内皮细胞损害和增殖状况。结果与对照组比较，孵育7天BCSF可使内皮细胞出现明显的病理形态学改变，贴壁细胞数量减少，MTT吸光度下降（P<0.01），G0～G1期细胞比例增高（P<0.01）。结论BCSF可直接造成明显的兔脑微血管内皮细胞病理形态学损害，并抑制血管内皮细胞代谢和增殖。　　关键词:脑血管痉挛;蛛网膜下腔出血;内皮细胞;兔　　Effectofexperimentalsubarachnoidhemorrhageonmicrovesselendothelialcellsofbrain　　CHENZhi，WUNan，LIFei，etal.　　（DepartmentsofNeurosurgery，SouthwestHospital，ThirdMilitaryMedicalUniversity，Chongqing400038，China）织梦好，好织梦　　Abstract:ObjectiveToestablishanendothelialcellmodelinvitrofollowingexperimentalsubarachnoidhemor-rhage，andstudythecytoxiceffectofbloodycerebrospinalfluid（BCSF）onendothelialcells.MethodsRabbitbrainmi-crovesselendothelialcells（BmvECs）weredividedintoacontrolgroupandaBCSFgroup.MTTassaywastakentoevalu-atetheinjuryofBCSFincubatedfordifferenttimeonBmvECsinordertodecidethesuitableBCSFaspathogen.Morpho-logicalchanges，cellcounting，MTTassay，flowcytometricanalysiswereusedtoevaluatethecytoxiceffectsonBmvECs.ResultsBCSFcouldcauseseveremorphologicchangesinBmvECsanddecreasedMTTassay，andincreasedcellpropor-tionofG0-G1ofBmvECs（P<0.01）.ConclusionBCSFcouldcausedirectinjuryonendothelialcells，includingmor-phologicalchangesanddecreasedproliferation.　　Keywords:cerebralvasospasm;subarachnoidhemorrhage;endothelialcells;rabbits织梦内容管理系统　　出血性脑血管疾病继发或颅脑创伤后蛛网膜下腔出血（SAH）诱发的慢性脑血管痉挛（chroniccerebralvasospasm，CVS）是SAH致死或致残的主要原因，严重影响原发疾病的预后。CVS发生的病因和机制研究已持续了数十年，至今尚未完全阐明。大量研究已证实血管内皮细胞的损害在CVS发生发展中起到十分重要的作用，因此，血管内皮细胞的损害机制及保护是CVS防治研究的关键环节之一。本研究采用体外孵育的兔血性脑脊液（bloodycerebralspinalfluid，BCSF）模拟SAH刺激因素作用培养的兔脑微血管内皮细胞（brainmicrovesselendothelialcells，BmvECs），观察BCSF对内皮细胞病理形态学、增殖改变的影响，为建立CVS内皮细胞损伤模型及后续研究提供依据。　　材料与方法　　1兔脑微血管内皮细胞的分离、培养及鉴定　　8～12周大小的NewZealand白兔麻醉后颈动脉放血法处死，断头颅去皮后浸入75%的乙醇中消毒约1分钟，无菌状态下取出兔脑，分离出大脑皮质，按匀浆后筛网过滤法分离培养兔脑微血管内皮细胞;Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色鉴定脑微血管内皮细胞。内容来自dedecms　　2人工血性脑脊液的制备［1］　　无菌条件下取正常人血液与配制人工脑脊液，并按1:1比例混合;将其置于37℃水浴温箱中孵育7天后将样品取出离心（10100g，20分钟），留取上清液4℃贮存备用;使用前，将上述离心上清液与DMEM培养基按2:1的比例配制，即得到本研究中采用的血性脑脊液。　　3不同孵育时间BCSF对内皮细胞活力的影响　　将传代细胞分别接种于培养板或培养瓶培养至近汇合为单层，更换无血清培养基培养24小时，将细胞随机分为正常对照组（Control）、不同孵育天数的BCSF刺激组（BCSF1、BCSF3、BCSF5、BCSF7、BCSF9、BCSF12）。正常对照组加入无血清培养液，BCSF刺激组分别加入BCSF1、BCSF3、BCSF5、BCSF7、BCSF9、BCSF12。按上述分组以每孔1×104个细胞接种于96孔板中，37℃、5%CO2孵箱内静置培养，24小时后按分组处理;24小时后取出96孔板，每孔加入MTT溶液（5mg.ml）20μl后，继续37℃、5%CO2孵箱内静置培养4小时后终止培养，吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μl二甲亚砜，振荡10分钟;选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值。copyrightdedecms　　4实验细胞分组　　将传代细胞分别接种于培养板或培养瓶培养至近汇合为单层，更换无血清培养基培养24小时。根据上步的实验结果选择适当孵育天数的BCSF作为刺激因素，将细胞随机分为正常对照组（Control）、BCSF刺激组（BCSF）。织梦好，好织梦

　　5形态学观察

　　倒置显微镜形态观察各组实验细胞的生长状况及细胞形态，连续3天;实验细胞分组处理24小时后，用细胞刮将其刮下离心，3%戊二醛固定，1%四氧化锇后固定，常规包埋、切片、电子染色后2000EX透射电镜观察。

　　6内皮细胞增殖测定

　　（1）细胞计数:按上述分组将传代细胞接种于24孔培养板，处理结束后消化收集细胞，血球计数板计数。（2）流式细胞术细胞周期分析:按文献报道方法将各组细胞制成悬液后，加入PI至终浓度为50μg.ml进行荧光染色（避光，冰浴30分钟），4小时内上机检测细胞各周期的细胞数及占总细胞数的百分比。每个样品检测10000个细胞，计算G0.G1期、S期、G2.M期的细胞数及比例。