[摘要]目的：探讨LPS肝损伤的信号转导途径及LPS诱导肝细胞凋亡的规律。方法：Balb/c小鼠腹腔注射LPS建立内毒素血症模型，在不同时间点取其肝脏，HE染色观察病理改变，RT-PCR法检测肝组织TLR4的表达。TUNEL法检测肝细胞凋亡，免疫组化法检测bax、bcl-2、Fas、Fasl表达。结果：LPS注入腹腔后24h小鼠肝脏开始出现明显病理改变；3-6h肝细胞凋亡达高峰，12h后明显减少；肝脏TLR4在LPS注射3h后显著下调，6-12h明显受抑制，24h后则基本恢复；LPS刺激后3-6h肝脏bax、Fas表达达高峰，而bcl-2、Fasl表达在6-12h达到高峰，随后都逐渐下降。结论：LPS刺激肝脏后，肝损伤呈时间依从性，凋亡是其细胞死亡方式之一。LPS刺激后，肝脏TLR4表达呈时间依从性，TLR4表达下调可能是对LPS产生的耐受现象，是机体抗损伤的一种保护性的下调。LPS所致肝细胞凋亡是多因素作用的结果。　　[关键词]脂多糖；肝损伤；凋亡；Toll样受体4　　[中图分类号]R575[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2007）04（c）-027-04　　肝硬化是我国常见疾病和死亡病因之一，有研究表明，炎症是促使肝硬化从代偿期向失代偿期发展的重要因素。脂多糖（lipopolysacchide，LPS）是革兰阴性菌胞壁内毒素的主要成分，也是革兰阴性菌激发宿主免疫应答导致机体损伤的主要因素。肝脏是肠源性内毒素攻击的首要器官，也是免疫损伤的常见靶器官。　　实验研究表明，LPS是通过Th1细胞因子TNF-α和IFN-γ导致肝脏损伤，对酒精诱导小鼠早期肝损伤模型研究发现，血浆内毒素激活细胞，促使TNF-α、IFN-γ、IL-6等炎性细胞因子表达增强，从而导致肝损伤。LPS不仅可以加重肝硬化、酒精性肝损伤，LPS本身就能导致肝损伤。但内毒素导致Th1细胞因子激发的信号转导途径以及后续产生组织损伤的机制尚不清楚。　　有研究报导，内毒素血症时TLR4在心脏、肺表达上调，脾、脑表达下调，而肝、肾表达无明显变化；亦有部分研究提示，LPS刺激鼠巨噬细胞可使其表面TLR4/MD-2复合物减少[3，4]，也有研究表明，LPS刺激后TLR4表达持续升高。这些研究在时间点、LPS剂量、实验结果等方面存在许多不一致，LPS刺激后肝脏TLR4的表达究竟是如何改变的仍不清楚。　　LPS、脂蛋白能诱导巨噬细胞和上皮细胞凋亡。TLR2与脂蛋白诱导的凋亡有关，这提示TLRs可能与感染诱导的细胞死亡有关。LPS通过MyD88、IRAK-1、FADD诱导上皮细胞凋亡[7，8]。因此，假设TLRs与微生物成分诱导的凋亡有关。目前，LPS如何诱导肝细胞凋亡及其规律变化还不清楚，而TLR4的表达变化是否也与肝细胞凋亡有关仍未阐明。　　因此，本研究从动物实验入手，拟动态观察LPS刺激肝脏后不同时相TLR4的表达变化，初步探讨LPS-TLR4信号转导途径与内毒素肝损伤的相关联系。另外，本实验研究还将就LPS刺激机体后不同时相TLR4的表达变化、肝细胞凋亡及其规律、凋亡相关因子等，初步探讨TLR4、肝细胞凋亡与LPS所致肝损伤的关系。　　　　1材料与方法　　1.1主要试剂　　RPMI1640培养基（GIBCO公司）；E.ColiLPS0111:B4（Sigma公司，溶于RPMI1640培养基）；TRIzol（GIBCORL公司）；ReverseTranscriptionSystem（Promega，CAT#A3500）；Taq酶（上海Promega公司）；PCR引物合成（北京赛百盛公司）；细胞凋亡试剂盒（武汉博士德公司，产品编号MK1020）；即用型SABC免疫组化染色试剂盒（武汉博士德公司，产品编号SA1020）；bcl-2、bax、Fas、Fasl一抗（武汉博士德公司，产品编号分别为BA0412、BA0315、BA0484、BA0049）；DAB显色试剂盒（武汉博士德公司，产品编号AR1022）。　　1.2Balb/c小鼠内毒素血症模型、分组　　Balb/c小鼠，6-8周龄，雄性，体重（20±1）g，购于中南大学湘雅二医院动物实验室，饲养于清洁级动物室。Balb/c小鼠称重后随机分为6组，每组8只：0h组：即正常对照组，腹腔注射RPMI1640培养液，0.4ml/只；3h组、6h组、12h组、24h组、30h组为腹腔注射LPS（4mg/kg）后第3、6、12、24、30h组。　　1.3动物实验：在各时间段观察小鼠一般情况并称重　　各组Balb/c鼠断颈处死小鼠，取部分肝脏于液氮中速冻，各取冻存肝脏100mg匀浆，各加入1mlTRIzol，-70℃保存以备抽提组织总RNA用；另外，每只小鼠取适量肝脏右叶于10%中性缓冲福尔马林溶液中固定，石蜡包埋，连续切片8张，每片厚4μm，一张做HE染色，其余留做细胞凋亡检测和免疫组织化学检测。　　1.4总RNA的抽提　　按TRIzol试剂盒说明书进行。TRIzol裂解物室温下静置15min，加入三氯甲烷0.2ml/mlTRIzol，剧摇15s，室温静置2min，12000×g4℃离心15min，移上清，加入异丙醇0.6ml/mlTRIzol，轻混匀，室温静置10min，≤11000×g4℃离心10min，弃上清，加75%乙醇1ml，7500×g4℃离心5min，弃上清，空气中干燥，加DEPC水溶解，55-60。C水浴10min，BeckmanDU-600UV可见分光光度计测定OD260和OD280，确定RNA浓度和纯度，-70℃保存备用。　　1.5逆转录cDNA第一链合成　　总RNA1.5μg,加DEPC处理水至9.75μl，70℃水浴10min，依次加入25mmol/LMgCl24μl,10×buffer2μl,10mmol/LdNTPMix2μl,RandomPrimer1μl,RnasinInhibitor0.5μl,AMVReverseTranscriptase0.75μl,总反应体系20μl，42℃60min，99℃5min后置于冰上，加80μldH2O稀释，-20℃保存。　　1.6、引物核苷酸序列　　DNAstar软件自行设计，由北京赛百盛公司合成。　　mouseTLR4primers（Bases2129-2149bp，318bp）　　Sense:5'-TCTGCCTTCACTACAGAGACT-3'　　Anti-sense:5'-AGTCTTCTCCAGAAGATGTGC-3'　　mouseGAPDHprimers（Bases260-833bp，573bp）　　Sense:5'-ATCACCATCTTCCAGGAGCG-3'　　Anti-sense:5'-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3'　　1.7聚合酶链反应　　cDNA模板5μl，25mmol/LMgCl21.5mmol/L，10mmol/LdNTPs0.16mmol/L，10×PCRbuffer2μl，引物100ng，TaqDNA多聚酶1μl，总体系20μl。TLR4PCR循环条件为：95℃预变性4min，94℃变性45s，54℃退火45s，72℃延伸80s，共35个循环，72℃共延伸10min。内对照GAPDH的PCR循环条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸1min，共28个循环，72℃共延伸7min。　　本文为全文原貌　未安装PDF浏览器下载安装　原版全文|||　　[摘要]目的：探讨LPS肝损伤的信号转导途径及LPS诱导肝细胞凋亡的规律。方法：Balb/c小鼠腹腔注射LPS建立内毒素血症模型，在不同时间点取其肝脏，HE染色观察病理改变，RT-PCR法检测肝组织TLR4的表达。TUNEL法检测肝细胞凋亡，免疫组化法检测bax、bcl-2、Fas、Fasl表达。结果：LPS注入腹腔后24h小鼠肝脏开始出现明显病理改变；3-6h肝细胞凋亡达高峰，12h后明显减少；肝脏TLR4在LPS注射3h后显著下调，6-12h明显受抑制，24h后则基本恢复；LPS刺激后3-6h肝脏bax、Fas表达达高峰，而bcl-2、Fasl表达在6-12h达到高峰，随后都逐渐下降。结论：LPS刺激肝脏后，肝损伤呈时间依从性，凋亡是其细胞死亡方式之一。LPS刺激后，肝脏TLR4表达呈时间依从性，TLR4表达下调可能是对LPS产生的耐受现象，是机体抗损伤的一种保护性的下调。LPS所致肝细胞凋亡是多因素作用的结果。　　[关键词]脂多糖；肝损伤；凋亡；Toll样受体4　　[中图分类号]R575[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2007）04（c）-027-04　　肝硬化是我国常见疾病和死亡病因之一，有研究表明，炎症是促使肝硬化从代偿期向失代偿期发展的重要因素。脂多糖（lipopolysacchide，LPS）是革兰阴性菌胞壁内毒素的主要成分，也是革兰阴性菌激发宿主免疫应答导致机体损伤的主要因素。肝脏是肠源性内毒素攻击的首要器官，也是免疫损伤的常见靶器官。　　实验研究表明，LPS是通过Th1细胞因子TNF-α和IFN-γ导致肝脏损伤，对酒精诱导小鼠早期肝损伤模型研究发现，血浆内毒素激活细胞，促使TNF-α、IFN-γ、IL-6等炎性细胞因子表达增强，从而导致肝损伤。LPS不仅可以加重肝硬化、酒精性肝损伤，LPS本身就能导致肝损伤。但内毒素导致Th1细胞因子激发的信号转导途径以及后续产生组织损伤的机制尚不清楚。　　有研究报导，内毒素血症时TLR4在心脏、肺表达上调，脾、脑表达下调，而肝、肾表达无明显变化；亦有部分研究提示，LPS刺激鼠巨噬细胞可使其表面TLR4/MD-2复合物减少[3，4]，也有研究表明，LPS刺激后TLR4表达持续升高。这些研究在时间点、LPS剂量、实验结果等方面存在许多不一致，LPS刺激后肝脏TLR4的表达究竟是如何改变的仍不清楚。　　LPS、脂蛋白能诱导巨噬细胞和上皮细胞凋亡。TLR2与脂蛋白诱导的凋亡有关，这提示TLRs可能与感染诱导的细胞死亡有关。LPS通过MyD88、IRAK-1、FADD诱导上皮细胞凋亡[7，8]。因此，假设TLRs与微生物成分诱导的凋亡有关。目前，LPS如何诱导肝细胞凋亡及其规律变化还不清楚，而TLR4的表达变化是否也与肝细胞凋亡有关仍未阐明。　　因此，本研究从动物实验入手，拟动态观察LPS刺激肝脏后不同时相TLR4的表达变化，初步探讨LPS-TLR4信号转导途径与内毒素肝损伤的相关联系。另外，本实验研究还将就LPS刺激机体后不同时相TLR4的表达变化、肝细胞凋亡及其规律、凋亡相关因子等，初步探讨TLR4、肝细胞凋亡与LPS所致肝损伤的关系。　　　　1材料与方法　　1.1主要试剂　　RPMI1640培养基（GIBCO公司）；E.ColiLPS0111:B4（Sigma公司，溶于RPMI1640培养基）；TRIzol（GIBCORL公司）；ReverseTranscriptionSystem（Promega，CAT#A3500）；Taq酶（上海Promega公司）；PCR引物合成（北京赛百盛公司）；细胞凋亡试剂盒（武汉博士德公司，产品编号MK1020）；即用型SABC免疫组化染色试剂盒（武汉博士德公司，产品编号SA1020）；bcl-2、bax、Fas、Fasl一抗（武汉博士德公司，产品编号分别为BA0412、BA0315、BA0484、BA0049）；DAB显色试剂盒（武汉博士德公司，产品编号AR1022）。　　1.2Balb/c小鼠内毒素血症模型、分组　　Balb/c小鼠，6-8周龄，雄性，体重（20±1）g，购于中南大学湘雅二医院动物实验室，饲养于清洁级动物室。Balb/c小鼠称重后随机分为6组，每组8只：0h组：即正常对照组，腹腔注射RPMI1640培养液，0.4ml/只；3h组、6h组、12h组、24h组、30h组为腹腔注射LPS（4mg/kg）后第3、6、12、24、30h组。　　1.3动物实验：在各时间段观察小鼠一般情况并称重　　各组Balb/c鼠断颈处死小鼠，取部分肝脏于液氮中速冻，各取冻存肝脏100mg匀浆，各加入1mlTRIzol，-70℃保存以备抽提组织总RNA用；另外，每只小鼠取适量肝脏右叶于10%中性缓冲福尔马林溶液中固定，石蜡包埋，连续切片8张，每片厚4μm，一张做HE染色，其余留做细胞凋亡检测和免疫组织化学检测。　　1.4总RNA的抽提　　按TRIzol试剂盒说明书进行。TRIzol裂解物室温下静置15min，加入三氯甲烷0.2ml/mlTRIzol，剧摇15s，室温静置2min，12000×g4℃离心15min，移上清，加入异丙醇0.6ml/mlTRIzol，轻混匀，室温静置10min，≤11000×g4℃离心10min，弃上清，加75%乙醇1ml，7500×g4℃离心5min，弃上清，空气中干燥，加DEPC水溶解，55-60。C水浴10min，BeckmanDU-600UV可见分光光度计测定OD260和OD280，确定RNA浓度和纯度，-70℃保存备用。　　1.5逆转录cDNA第一链合成　　总RNA1.5μg,加DEPC处理水至9.75μl，70℃水浴10min，依次加入25mmol/LMgCl24μl,10×buffer2μl,10mmol/LdNTPMix2μl,RandomPrimer1μl,RnasinInhibitor0.5μl,AMVReverseTranscriptase0.75μl,总反应体系20μl，42℃60min，99℃5min后置于冰上，加80μldH2O稀释，-20℃保存。　　1.6、引物核苷酸序列　　DNAstar软件自行设计，由北京赛百盛公司合成。　　mouseTLR4primers（Bases2129-2149bp，318bp）　　Sense:5'-TCTGCCTTCACTACAGAGACT-3'　　Anti-sense:5'-AGTCTTCTCCAGAAGATGTGC-3'　　mouseGAPDHprimers（Bases260-833bp，573bp）　　Sense:5'-ATCACCATCTTCCAGGAGCG-3'　　Anti-sense:5'-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3'　　1.7聚合酶链反应　　cDNA模板5μl，25mmol/LMgCl21.5mmol/L，10mmol/LdNTPs0.16mmol/L，10×PCRbuffer2μl，引物100ng，TaqDNA多聚酶1μl，总体系20μl。TLR4PCR循环条件为：95℃预变性4min，94℃变性45s，54℃退火45s，72℃延伸80s，共35个循环，72℃共延伸10min。内对照GAPDH的PCR循环条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸1min，共28个循环，72℃共延伸7min。　　本文为全文原貌　未安装PDF浏览器下载安装　原版全文|||　　1.8半定量PCR　　PCR产物以2%琼脂糖70V电泳50min，0.15%溴乙锭染色，凝胶影像分析系统测得各产物OD值，以ODTLR4/ODGAPDH比值代表基因表达量的相对多少。　　1.9基因检测　　末端脱氧核糖核酸转移酶原位标记法检测肝细胞凋亡，免疫组化方法（SABC法）检测肝组织bcl-2、bax、Fas、Fasl表达。　　1.10统计学处理　　用SPSS10.0统计软件包，对计量资料先进行方差齐性检验，方差齐者，用单因素方差分析（one-wayANOVA）检验总体均数差异性，有显著性差异者再两两进行比较（Student-Newman-KeulsTest）。P　　　　2实验结果　　2.1LPS刺激不同时间点小鼠肝脏组织病理学改变　　腹腔注射LPS后，0-6h组无明显病理改变，12h组肝脏少量炎性细胞浸润；24h组肝窦充血、淤血及肝细胞浊肿加重，少量炎性细胞浸润，肝细胞少许点状坏死；30h组肝窦明显充血、淤血，大量炎性细胞浸润，肝细胞浊肿加重，呈现点状、小片状或多灶性坏死。　　2.2LPS刺激后不同时间点小鼠肝脏TLR4mRNA表达的变化　　LPS刺激后3h肝脏TLR4mRNA表达明显减少；6h组、12h组TLR4mRNA表达受抑制；24h组TLR4mRNA表达开始恢复（与3h组、6h组、12h组比较有显著性差异，P　　图1LPS刺激后不同时间点小鼠肝脏TLR4mRNA表达变化　　2.3LPS刺激不同时间点肝细胞凋亡的检测　　0h对照组肝细胞凋亡阳性数少；3h组肝细胞凋亡数目明显增加；6h组凋亡数上升达高峰；12h组肝细胞凋亡数显著减少；24h组、30h组肝细胞凋亡数基本恢复到对照组水平。各组凋亡指数（AI）比较，见图2。　　图2Balb/c鼠LPS刺激后不同时间肝细胞凋亡指数　　2.4LPS刺激后不同时间段bax、bcl-2的表达　　bax、bcl-2阳性表达主要分布在肝细胞胞核。0h对照组bax、bcl-2阳性数少；3h组bax阳性数目明显增加达高峰，bcl-2表达稍有增加；6h组bax阳性数较3h组减少，而bcl-2阳性数显著上升；12h组bax下降显著、bcl-2阳性数显著增加达高峰；24h组、30h组bax阳性数逐渐下降到较低水平，bcl-2下降后持续在较高水平（图3）。　　2.5LPS刺激后不同时间段Fas、Fasl的表达　　Fas、Fasl阳性表达主要也分布在肝细胞胞核，阳性细胞主要集中在汇管区周围。0h对照组Fas、Fasl阳性数都很少；　　图3LPS刺激后不同时间bax、bcl-2表达变化　　　　3h组Fas阳性数目明显增加达高峰，Fasl表达稍有增加；6h组Fas阳性数较3h组减少，而Fasl阳性数显著上升；12h组Fas下降显著、Fasl阳性数显著增加达高峰；24h组、30h组Fas、Fasl阳性数都逐渐下降到较低水平（图4）。　　图4LPS刺激后不同时间Fas、Fasl表达变化　　　　3讨论　　细菌内毒素脂多糖是革兰阴性菌外膜层的主要成分，革兰阴性菌所致的机体损伤主要也是由LPS介导。肝脏是清除内毒素和解毒的主要脏器，也是肠源性内毒素攻击的首要器官。实验研究表明，LPS不仅可以加重肝硬化、酒精性肝损伤，LPS本身就能够导致肝损伤[3、11、12]。在已经有肝病的基础上，再加上内毒素的损伤，则具有重要的临床意义。　　本研究发现LPS对小鼠肝脏有明显的毒性作用，其损伤的变化具有一定规律。小鼠的肝脏随LPS刺激时间延长而呈现的病理改变：12h变化尚不明显，24h后病理改变明显，至30h（死亡小鼠）肝脏大量炎性细胞浸润，呈现点状、小片状或多灶性坏死。这种肝损伤12h后出现的延迟性改变表明，LPS对肝脏不是直接的急性损伤，可能是通过其它途径间接作用。　　LPS能导致肝脏损伤，其损伤机制是研究热点，尤其是Toll样受体的发现为研究内毒素损伤提供了新的方向。TLRS是新近发现的哺乳动物细胞中一种果蝇膜蛋白Toll的类似物，通过识别不同的病原体相关分子模式（PAMP）启动下游信号分子，激活天然免疫系统。TLRS家族的TLR4是天然免疫系统识别LPS的特异性跨膜受体。本实验发现，LPS刺激后3h肝脏TLR4mRNA的表达开始明显减少；6h、12h基本检测不到TLR4mRNA的表达；24h后TLR4mRNA表达开始逐渐恢复。TLR4的这种动态变化表明LPS注射后不同时相TLR4的表达量不同，同时TLR4的表达与LPS所致肝损伤有关。此结果与已有研究报道有所不同可能是因为本研究在注射LPS后不同时间点检测TLR4mRNA表达，是一个动态观察过程，而其它研究未作动态观察而得到LPS刺激后肝脏TLR4的表达有的降低有的上升的矛盾结论。机体存在内毒素产生耐受现象，FumikoNomura等发现，LPS初次刺激时，体外培养的巨噬细胞TLR4表达下调，随LPS刺激时间延长，其表面TLR4持续下调，LPS再刺激时出现耐受现象，提示LPS耐受与细胞表面TLR4表达下调有关[13]。本研究发现LPS腹腔注射后的不同时间点，肝组织TLR4的表达呈现类似变化，提示肝脏可能出现类似的LPS耐受现象，TLR4表达的下调是机体对LPS攻击的一种保护机制。　　肝细胞坏死在LPS刺激24h后明显，本研究对LPS刺激后肝细胞凋亡情况也做了检测。研究发现，LPS刺激Balb/c小鼠后3-6h肝细胞凋亡数上升达高峰，12h后凋亡数逐渐减少。这提示肝细胞凋亡与肝脏病理变化并不同步，远早于肝组织的病理改变，单独LPS可促进肝细胞凋亡，凋亡后会出现序贯性的坏死。有研究表明，酒精、四氯化碳、Gal-N等联合LPS导致肝脏损伤中，促炎性细胞因子介导的细胞凋亡在其中起了重要作用，肝组织出现凋亡、坏死并存[14]。另外，阻断转录因子NF-κB可使凋亡增加，SchoemakerMH等发现肝细胞凋亡抑制蛋白2（inhibitorofapoptosisprotein，2cIAP2）表达上调依赖于NF-κB，抗凋亡基因bcl-2家族成员A1/Bfl-1、促凋亡基因Bak、Bid的表达上调也依赖于NF-κB[15,16]，提示肝脏受损伤时，NF-κB活化并启动抗凋亡基因、促凋亡基因的表达，损伤与修复同时启动，但其调控机制仍不清楚。本研究发现LPS所致肝损伤过程中，凋亡、坏死在时间上的序贯性改变是否与损伤、修复同时启动而损伤、修复不平衡有关，尚需进一步研究。　　bcl-2是抑制凋亡的基因，可抑制由多种细胞毒素引起的细胞死亡，bax则为促进凋亡发生的基因，bcl-2/bax的比率决定了细胞的生存或死亡[17]。本实验发现，bax在LPS刺激3h内就增加并达到高峰，LPS刺激6h后逐渐下降，bcl-2的增加在凋亡高峰期开始（即LPS刺激6h后），在凋亡后期（即LPS刺激12h后）达高峰，bcl-2/bax的比率由凋亡初期的1/5逐渐增加到凋亡高峰期的1，之后增加到凋亡后期的2。bcl-2/bax的比率改变可以解释LPS刺激后小鼠肝细胞凋亡的时相变化，bcl-2/bax的比率改变也可以间接地反映出细胞凋亡的程度。　　本文为全文原貌　未安装PDF浏览器下载安装　原版全文|||　　本研究发现，在LPS刺激后，Fas、Fasl的表达都增加，其高峰分别出现在LPS刺激后3h、12h。Fas的表达高峰早于凋亡的高峰，与凋亡高峰有部分重叠。Fasl的表达高峰则与凋亡高峰大部分重叠。有研究表明Fas-Fasl介导凋亡过程需3-4h，与本研究结果接近。Fas和Fasl阳性细胞主要集中在汇管区周围，Fas和Fasl的高表达部位也是凋亡发生的主要部位，提示Fas-Fasl系统与LPS所致的肝细胞凋亡有关，但有关Fas介导凋亡信号如何诱导还不清楚。这些现象进一步说明LPS所致肝细胞凋亡并非单个因素在其作用，而是多因素作用的结果，在LPS所致肝损伤过程中，可能Fas-Fasl系统、TNF-α/TNFR系统在肝细胞凋亡中都发挥其各自的作用，但是各个系统对于凋亡的启动和促进的具体作用还有待进一步研究证实。　　总之，本研究结果表明LPS刺激肝脏后，肝损伤呈时间依从性，凋亡是其细胞死亡方式之一，肝细胞凋亡、坏死是序贯出现。LPS刺激肝脏后，肝脏TLR4表达呈时间依从性，TLR4表达下调可能是细胞对LPS产生的耐受现象，是机体对抗损伤的一种保护性的下调。bax、bcl-2、Fas、Fas表达变化与LPS所致肝细胞凋亡有关，LPS所致肝细胞凋亡是多因素作用的结果。　　[参考文献]　　TakehikoU,MatthiasF,GavinE.A,etal.Toll-likereceptor4isinvolvedinthemechanismofearlyalcohol-inducedliverinjuryinmice[J].Hepatology,2001,34:101-108.　　MatsumuraT,ItoA,TakiiT,etal.EndotoxinandcytokineregulationofToll-likereceptor（TLR）2andTLR4geneexpressioninmurineliverandhepatocytes[J].InterferonCytokineRes,2000,20（10）:915-921.　　SmileyST,KingJA,HancockWW.Fibrinogenstimulatesmacrophagechemokinesecretionthroughtoll-likereceptor4[J].JImmunol,2001Sep1;167（5）:2887-94.　　NomuraF,AkashiS,SakaoY,etal.Cuttingedge:endotoxintoleranceinmouseperitonealmacrophagescorrelateswithdown-regulationofsurfacetoll-likereceptor4expression[J].JImmunol,2000,164（7）:3476-9.　　冯俊明，史景泉，刘友生.脂多糖对枯否细胞中CD14、TOLL样受体4表达的影响及其意义[J].中华实验外科杂志，2002，19（4）：350-351.　　AliprantisAO,YangRB,MarkMR,etal.Cellactivationandapoptosisbybacteriallipoproteinsthroughtoll-likereceptor-2[J].Science,1999,285（5428）:736-9.　　ChoiKB,WongF,HarlanJM,etal.LipopolysaccharidemediatesendothelialapoptosisbyaFADD-dependentpathway[J].JBiolChem,1998,273（32）:20185-8.　　[8]BannermanDD,TupperJC,ErwertRD,etal.Divergenceofbacteriallipopolysaccharidepro-apoptoticsignalingdownstreamofIRAK-1[J].JBiolChem,2002,277（10）:8048-53.　　[9]ManeulPerez-Ruiz,JosefaR,ManuelM-R,etal.Vascularendthelialgrowthfactorproductioninperotonealmacrophagesofcirrhoticpatients:regulationbycytokinesandbacteriallipopolysaccharide[J].Hepotology,1999,29:1057-1063.　　[10]MichaelD.J,F.RenaB,KunitaroF,etal.LipopolysacchideandD-galactosamine-inducedhepaticinjuryismediatedbyTNF-αandnotbyFasligand[J].AmJPhysiolRegulatoryIntegrativeCompPhysiol,2001,278:R1196-R1201.　　[11]FumkoNomura,F.RenaB,MarkMR,etal.Cuttingedge:Endotoxintoleranceinmouseperotonealmacrophagescorrelateswithdown-regulationofsurfacetoll-likereceptor4expression[J].Jimmunol2000,164:3476-3479.　　[12]MurohisaG,KobayashiY,KawasakiT,etal.Involvementofplatelet-activatingfactorinhepaticapoptosisandnecrosisinchronicethanol-fedratsgivenendotoxin[J].Liver,2002,22（5）:394-403.　　[13]SchoemakerMH,RosJE,HomanM,etal.Cytokineregulationofpro-andanti-apoptoticgenesinrathepatocytes:NF-kappaB-regulatedinhibitorofapoptosisprotein2（cIAP2）preventsapoptosis[J].JHepatol,2002,36（6）:742-50.　　[14]ZhaoY,LiS,ChildsEE,etal.Activationofpro-deathBcl-2familyproteinsanddmitochondriaapoptosispathwayintumornecrosisfactor-alpha-inducedliverinjury[J].JBiolChem,2001,276（29）:27432-27440.　　[15]ChenJ,GrahaSH,ChemPH,etal.Bcl-2isexpressedinneuronsthatsurvivefocalischemiaintherat[J].Neureport,1995,6（2）:394-397.　　（收稿日期：2007-03-08）　　本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。　　本文为全文原貌　未安装PDF浏览器下载安装　原版全文脂多糖诱发肝损伤机理的初步研究游　宇　卢放根　刘小伟　吴小平　刘德良