除根据临床表现外，可采取脑脊液、心包液胸腔积液、疱液、血液作病毒分离，亦可做活检标本、咽拭子直肠拭子、粪便等进行细胞培养，但消化道培养分离的病毒只可作为诊断参考。亦可以乳鼠接种分离鉴定病毒由于血清型较多，存在一定困难早期和恢复期分别进行血清中和试验或补体结合试验，效价在4倍以上或疾病早期检测到特异性IgM抗体，则有诊断意义　　1.流行病学资料 夏秋季流行，小儿居多，一家中多人发病等有参考意义有近期内本地区流行的资料在诊断上尤有价值。　　2.临床特征 一些有特征性的临床表现，如口腔内疱疹、胸痛或肌痛、心肌炎、脑膜炎、特殊皮疹等对协助诊断均有价值。白细胞总数正常双峰热等也有一定参考意义当新生儿有任何流行性的严重疾病，以及新生儿突然发生心肺功能严重障碍时均应考虑柯萨奇病毒感染的可能。在夏秋季遇原因不明的发热和(或)皮疹，特别当患者为婴幼儿时，也应怀疑柯萨奇病毒感染。　　3.确诊依据 因健康人群的肠道内常有此类病毒，如仅在患者的粪便或肛拭中分离出柯萨奇病毒时不能凭此而即下结论，宜以下列几点为确诊依据：　　(1)从患者的各种体液或分泌物如脑脊液、血液、疱浆液、胸腔积液等，或尸检脏器如心、脑、肝脾等中分离出病毒　　(2)用双份血清作中和试验(或其他血清学检查)抗体效价上升4倍以上。　　(3)在患者中的病毒分离率远高于未接触患者的正常对照组。　　(4)无其他已知病原体能引起此类综合征，而从患者的咽洗液、咽拭、粪便、肛拭等之中却能重复分离到同一病毒，并从周围接触者中也检出相同的病毒。http://jibing.jiankang4.com