从受感染体液或组织标本的培养，或在痰液、胸腔液、脑脊液、引流窦道的病变渗出物直接检查，或在用银或PAS染色的组织活检标本中，检出粗球孢子菌的小球体便可确诊。完整小球体的直径常为20~80μm，厚壁，充满小的内孢子(直径2~4μm)。从破裂的小球体释放并进入组织的内孢子可被误认为是无芽酵母菌。

补体结合试验检测抗球孢子菌IgG抗体仍是最有用的试验。血清滴度≥1:4表明存在现感染或新近的感染，更高滴度(≥1:32)表示极有可能已发生肺外感染。然而，免疫抑制病人却可能出现低滴度。成功的治疗滴度应当下降。脑脊液中出现补体结合的抗体可确诊球孢子菌脑膜炎，这是很重要的，因为仅极少数病例可呈培养阳性。

其他抗体试验，包括更新、更敏感和特异的免疫学试验均不能判断预后，用处不大。免疫功能正常者通常在感染后10~21天内可出现对球孢子菌素或小球体素引起的皮肤迟发性变态反应，但进行性疾病则特征性地缺乏该反应。由于该试验在地方性流行区多数人呈阳性反应，所以，主要用于流行病学研究而不是用于诊断。